Analytical strategies for the characterization, identification, and quantification of peptides and proteins of interest in the prevention and understanding of hypertension

Premio Extraordinario de Doctorado de la UAH en el año académico 2013-2014La hipertensión constituye un serio problema de salud y está considerada como una de las causas de las enfermedades cardiovasculares y renales. A pesar de la prevalencia de la hipertensión, la mitad de las personas afectadas desconocen que la padecen. Además, los estudios realizados acerca de las causas más importantes de muerte en el mundo predicen un aumento de la contribución de las enfermedades cardiovasculares. Debido a que los síntomas de la hipertensión pueden permanecer inadvertidos y raramente se ponen de manifiesto, la prevención y tratamiento de la hipertensión se consideran de gran importancia en la sociedad moderna. El tratamiento de la hipertensión ha disminuido la incidencia de accidentes cardiovasculares. Sin embargo, aunque la utilización de fármacos sintéticos ha sido decisiva en este descenso, estos fármacos poseen habitualmente efectos secundarios. Una alternativa interesante a estos fármacos la constituyen algunos péptidos que se encuentran de forma natural en determinados alimentos. De hecho, una estrategia básica para mejorar la salud cardiovascular es modificar la dieta y el estilo de vida ya que la dieta es uno de los factores que más influencia tienen en la salud humana. Entre los compuestos bioactivos que se encuentran en los alimentos, los péptidos bioactivos están recibiendo una gran atención en los últimos años. En particular, los péptidos antihipertensivos y antioxidantes son los más estudiados y han demostrado su efecto positivo sobre la salud cardiovascular. En efecto, los péptidos antihipertensivos pueden inhibir la actividad de la ACE y disminuir la presión arterial. Por su parte, los péptidos antioxidantes previenen el estrés oxidativo que puede iniciar y promover la aparición de la hipertensión. Los péptidos bioactivos pueden ser ingredientes naturales de los alimentos o bien originarse a partir de proteínas alimentarias de las que forman parte ya sea por procedimientos in vivo o in vitro. La digestión gastrointestinal constituye en sí misma un procedimiento in vivo mientras que el procedimiento in vitro implica la hidrólisis de las proteínas por la acción de enzimas o microorganismos adicionados a los alimentos. En el caso de productos procesados, los péptidos bioactivos se liberan a partir de las proteínas durante el procesado del alimento (queso, yogurt, kéfir, etc.). Hasta la fecha, la investigación relacionada con péptidos antihipertensivos y antioxidantes se ha centrado principalmente en alimentos de origen animal como la leche, los productos lácteos y la carne. Sin embargo, los péptidos bioactivos de origen vegetal, aunque menos estudiados, a menudo poseen actividades más altas. El maíz y la soja, son ejemplos de fuentes de péptidos bioactivos de elevada actividad. Las fórmulas infantiles de soja (SBIFs) constituyen una alternativa muy interesante a la leche y los productos lácteos para niños con intolerancia o alergia a algunos constituyentes de la leche, con problemas de alimentación o pertenecientes a familias vegetarianas. Sin embargo, en comparación con la leche y los productos lácteos, las SBIFs han sido poco investigadas en lo que al contenido de péptidos bioactivos se refiere. Estas fórmulas infantiles se elaboran a partir de aislados de proteína de soja que contienen alrededor de un 90% de proteínas. Durante su preparación, se someten a calor intenso o a hidrólisis proteica. Así, las SBIFs pueden contener de forma natural péptidos potencialmente bioactivos con efectos beneficiosos sobre la salud a parte de sus beneficios nutricionales. En este trabajo, las SBIFs se han elegido como una fuente potencial de péptidos bioactivos. Se han propuesto cuatro métodos diferentes para extraer péptidos de las SBIFs. En este trabajo, se ha desarrollado una metodología analítica para la determinación simultánea de los péptidos LRP, LSP y LQP de las [alfa]-zeínas presentes en granos de maíz. Adicionalmente, se desarrolló una metodología analítica por HPLC-Q-ToF-MS para la determinación de los tres péptidos mencionados en maíz. Con fines a llevar a cabo la determinación del péptido VLIVP en habas de soja, en este trabajo se desarrolló también una metodología analítica utilizando HPLC capilar acoplada a un sistema de espectrometría de masas de trampa de iones (HPLC capilar-IT-MS). Finalmente, en este trabajo se ha desarrollado un método SRM (selected reaction monitoring) utilizando detección por espectrometría de masas de triple cuadrupolo (QqQ) para evaluar el contenido de las isoformas de las proteínas kinasas PKA, PKG y CaMKII en distintos tejidos de rata. A modo de resumen, en este trabajo se ha investigado por primera vez la presencia de péptidos bioactivos nativos presentes en SBIFs. Estos estudios han permitido obtener una visión amplia del potencial de los péptidos bioactivos presentes en estos alimentos para bebés y al mismo tiempo observar grandes diferencias entre ellos contribuyendo a incrementar el conocimiento del valor nutricional real de estos alimentos así como de sus efectos fisiológicos y biológicos. Por otra parte, también se han desarrollado metodologías analíticas para la determinación de péptidos inhibidores de la ACE altamente potentes en cultivos de maíz y soja. Estos métodos se han caracterizado y se han aplicado al análisis de diferentes variedades de estos cultivos. Los resultados obtenidos tienen un importante potencial en el campo de la ciencia de los alimentos íntimamente relacionada con el área de la biomedicina. Finalmente, otro aspecto investigado en este trabajo ha sido la determinación de isoformas de proteínas de alto interés cardiovascular en diferentes tejidos de rata. Aunque se desarrolló un método SRM apropiado, la complejidad de la muestra no permitió la cuantificación fiable de las isoformas de PKA, PKG y CaMKII por lo que son necesarios más estudios para superar esta dificultad. Una vez superada, esta estrategia podría tener un impacto enorme en la investigación de los mecanismos moleculares que intervienen en el sistema cardiovascular

Analytical strategies for the characterization, identification, and quantification of peptides and proteins of interest in the prevention and understanding of hypertension

Premio Extraordinario de Doctorado de la UAH en el año académico 2013-2014La hipertensión constituye un serio problema de salud y está considerada como una de las causas de las enfermedades cardiovasculares y renales. A pesar de la prevalencia de la hipertensión, la mitad de las personas afectadas desconocen que la padecen. Además, los estudios realizados acerca de las causas más importantes de muerte en el mundo predicen un aumento de la contribución de las enfermedades cardiovasculares. Debido a que los síntomas de la hipertensión pueden permanecer inadvertidos y raramente se ponen de manifiesto, la prevención y tratamiento de la hipertensión se consideran de gran importancia en la sociedad moderna. El tratamiento de la hipertensión ha disminuido la incidencia de accidentes cardiovasculares. Sin embargo, aunque la utilización de fármacos sintéticos ha sido decisiva en este descenso, estos fármacos poseen habitualmente efectos secundarios. Una alternativa interesante a estos fármacos la constituyen algunos péptidos que se encuentran de forma natural en determinados alimentos. De hecho, una estrategia básica para mejorar la salud cardiovascular es modificar la dieta y el estilo de vida ya que la dieta es uno de los factores que más influencia tienen en la salud humana. Entre los compuestos bioactivos que se encuentran en los alimentos, los péptidos bioactivos están recibiendo una gran atención en los últimos años. En particular, los péptidos antihipertensivos y antioxidantes son los más estudiados y han demostrado su efecto positivo sobre la salud cardiovascular. En efecto, los péptidos antihipertensivos pueden inhibir la actividad de la ACE y disminuir la presión arterial. Por su parte, los péptidos antioxidantes previenen el estrés oxidativo que puede iniciar y promover la aparición de la hipertensión. Los péptidos bioactivos pueden ser ingredientes naturales de los alimentos o bien originarse a partir de proteínas alimentarias de las que forman parte ya sea por procedimientos in vivo o in vitro. La digestión gastrointestinal constituye en sí misma un procedimiento in vivo mientras que el procedimiento in vitro implica la hidrólisis de las proteínas por la acción de enzimas o microorganismos adicionados a los alimentos. En el caso de productos procesados, los péptidos bioactivos se liberan a partir de las proteínas durante el procesado del alimento (queso, yogurt, kéfir, etc.). Hasta la fecha, la investigación relacionada con péptidos antihipertensivos y antioxidantes se ha centrado principalmente en alimentos de origen animal como la leche, los productos lácteos y la carne. Sin embargo, los péptidos bioactivos de origen vegetal, aunque menos estudiados, a menudo poseen actividades más altas. El maíz y la soja, son ejemplos de fuentes de péptidos bioactivos de elevada actividad. Las fórmulas infantiles de soja (SBIFs) constituyen una alternativa muy interesante a la leche y los productos lácteos para niños con intolerancia o alergia a algunos constituyentes de la leche, con problemas de alimentación o pertenecientes a familias vegetarianas. Sin embargo, en comparación con la leche y los productos lácteos, las SBIFs han sido poco investigadas en lo que al contenido de péptidos bioactivos se refiere. Estas fórmulas infantiles se elaboran a partir de aislados de proteína de soja que contienen alrededor de un 90% de proteínas. Durante su preparación, se someten a calor intenso o a hidrólisis proteica. Así, las SBIFs pueden contener de forma natural péptidos potencialmente bioactivos con efectos beneficiosos sobre la salud a parte de sus beneficios nutricionales. En este trabajo, las SBIFs se han elegido como una fuente potencial de péptidos bioactivos. Se han propuesto cuatro métodos diferentes para extraer péptidos de las SBIFs. En este trabajo, se ha desarrollado una metodología analítica para la determinación simultánea de los péptidos LRP, LSP y LQP de las [alfa]-zeínas presentes en granos de maíz. Adicionalmente, se desarrolló una metodología analítica por HPLC-Q-ToF-MS para la determinación de los tres péptidos mencionados en maíz. Con fines a llevar a cabo la determinación del péptido VLIVP en habas de soja, en este trabajo se desarrolló también una metodología analítica utilizando HPLC capilar acoplada a un sistema de espectrometría de masas de trampa de iones (HPLC capilar-IT-MS). Finalmente, en este trabajo se ha desarrollado un método SRM (selected reaction monitoring) utilizando detección por espectrometría de masas de triple cuadrupolo (QqQ) para evaluar el contenido de las isoformas de las proteínas kinasas PKA, PKG y CaMKII en distintos tejidos de rata. A modo de resumen, en este trabajo se ha investigado por primera vez la presencia de péptidos bioactivos nativos presentes en SBIFs. Estos estudios han permitido obtener una visión amplia del potencial de los péptidos bioactivos presentes en estos alimentos para bebés y al mismo tiempo observar grandes diferencias entre ellos contribuyendo a incrementar el conocimiento del valor nutricional real de estos alimentos así como de sus efectos fisiológicos y biológicos. Por otra parte, también se han desarrollado metodologías analíticas para la determinación de péptidos inhibidores de la ACE altamente potentes en cultivos de maíz y soja. Estos métodos se han caracterizado y se han aplicado al análisis de diferentes variedades de estos cultivos. Los resultados obtenidos tienen un importante potencial en el campo de la ciencia de los alimentos íntimamente relacionada con el área de la biomedicina. Finalmente, otro aspecto investigado en este trabajo ha sido la determinación de isoformas de proteínas de alto interés cardiovascular en diferentes tejidos de rata. Aunque se desarrolló un método SRM apropiado, la complejidad de la muestra no permitió la cuantificación fiable de las isoformas de PKA, PKG y CaMKII por lo que son necesarios más estudios para superar esta dificultad. Una vez superada, esta estrategia podría tener un impacto enorme en la investigación de los mecanismos moleculares que intervienen en el sistema cardiovascular

Isolation and characterization of peptides with antihypertensive activity in foodstuffs

Hypertension is one of the main causes of cardiovascular diseases. Synthetic drugs inhibiting ACE activity present high effectiveness in the treatment of hypertension but cause undesirable side effects. Unlike these synthetic drugs, antihypertensive peptides do not show any adverse effect. These peptides are naturally present in some foods and since hypertension is closely related to modern diet habits, the interest for this kind of foods is increasing. Different methods for the purification, isolation, and characterization of antihypertensive peptides in foods have been developed. Nevertheless, there is no revision work summarizing and comparing these strategies. In this review, in vivo and in vitro pathways to obtain antihypertensive peptides have been summarized. The ACE mechanism and the methodologies developed to assay the ACE inhibitory activity have also been described. Moreover, a comprehensive overview on the isolation, purification, and identification techniques focusing on the discovery of new antihypertensive peptides with high activity has been included. Finally, it is worthy to highlight that the quantitation of antihypertensive peptides in foods is a new trend since genotype and processing conditions could affect their presence. Analytical methodologies using mass spectrometry constitute an interesting option for this purpose

Fractionation and identification of antioxidant and angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides obtained from plum (Prunus domestica L.) stones

Peptides with antioxidant and ACE-inhibitory capacities have been obtained from a plum processing by-product. The aim of this work was to fractionate most active plum hydrolysates, to identify peptides in these fractions, and to evaluate their resistance to gastrointestinal enzymes. Highest antioxidant capacity was observed in the whole Alcalase hydrolysate while peptides yielding the highest ability to inhibit ACE were concentrated in the fraction <3 kDa from the Thermolysin hydrolysate. RP-HPLC–ESI-MS/MS enabled the identification of 13 and 7 potential antioxidant and ACE inhibitory peptides, respectively, in these fractions. Nevertheless, RP-HPLC alone did not guarantee the successful separation of all peptides. The combination of RP-HPLC and hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) coupled to ESI-Q-TOF-MS/MS enabled the identification of all peptides. Five potential antioxidant and three potential antihypertensive peptides could be additionally identified by HILIC. A total of 7 potential antioxidant peptides and 3 potential antihypertensive peptides resisted a simulated gastrointestinal digestion.Novozymes Spain S.A